StarLighter 高保真预混液

产品组分

储存及运输条件

-25 ~ - 15℃  保存 ，< 0℃  运输。

产品应用

使用简单 ， 只需加入模板、 引物、 水即可使用；

保真度为普通 Taq 酶的 70 倍；

可以扩增长片段。

注意事项

1. 请不要使用含尿嘧啶的引物和模板。

2. 2 × StarLighterHiFiReady Mix  具有较强的校正活性 ，产生的扩增产物是平末端 ，如果用于下一步克隆实验 ，建议使用平末端克隆。 如果扩增产物需要用于 TA  克隆 ，加 A  之前须先进行 DNA  纯化。

3. 为了提高扩增成功率和产量，请使用高质量的模板。

实验流程

1. 反应体系

1.1. 根据下表推荐，依次加入以下组分：

a. 模板推荐使用量：基因组DNA（10 ~200ng）；质粒活病毒DNA（10pg~50ng）；cDNA（1~5μL,不超过反应总体积 1/10）；粗品（1~5μL,不超过反应总体积 1/10）。

b. 当扩增片段 GC含量 >60% 且优化条件也无法正常扩增时，推荐使用 PCR Enhancer  来优化 PCR 反应。程序推荐：Touchdown PCR （降落 PCR）程序。

c. 引物反应终浓度可以在 0.1~ 1 μM  之间调整。

1.2. 轻柔吹打混匀后，短暂离心；

2. 推荐反应条件

2.1. 三步法:反应程序参考下表设置；

a. 对于普通模板，预变性可缩短至 30~60 sec；对于复杂模板，例如高GC 序列，推荐延长预变性时间到 3~5 min  以充分变性；大肠杆菌菌落 PCR:建议将预变性调整 10 min，无需预裂解即可高效扩增；酵母菌菌落 PCR：无需调整预变性时间，但需要对酵母菌进行预裂解。 建议使用以下预裂解方式：向酵母菌中添加终浓度 20 mM  的 NaOH 后 95℃预裂解 10 min，或将酵母菌使用液氮反复冻融2~5 次；

b. 根据引物 Tm值设置退火温度。如引物 Tm 值 ≥72℃,  可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤（两步法 PCR）。如果需要，可以建立一个温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性。如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度；

c. 对于大多数模板，30 sec/kb  即可有效扩增；对于一些复杂模板，可延长延伸时30~60 sec/kb

2.2. 二步法:反应程序参考下表设置；

通常情况下使用两步法和三步法进行 PCR  扩增，性能无显著差异，可以根据操作习惯自行选择 。但对于一些复杂模板（如长片段， Tm  分布不均匀 ,  特殊结构模板），可以尝试两步法或者 Touchdown PCR(降落 PCR) 。此外，使用质粒为模板进行点突变时，也建议使用两步法。

2.3. Touchdown PCR(降落 PCR)： 反应程序参考下表设置；

该程序仅供参考，Touchdown PCR（降落 PCR）有多种程序可灵活调整，请根据实验需求与习惯自行决定是否采用。 

常见问题